Edificata di fronte a Santa Maria della Vittoria, primo edificio di culto costruito nella nuova città voluta dal Gran Maestro Jean Parisot de la Vallette dopo il grande assedio del 1565, la chiesa di Santa Caterina d’Alessandria è annessa all’Auberge della Lingua d’Italia, residenza dei Cavalieri italiani a La Valletta. Il nucleo originario della chiesa, sorto come cappella privata, venne progettato dall’architetto dell’Ordine Gerosolimitano Girolamo Cassar tra il 1576 e il 1579 su commissione di fra’ Ludovico Folchi, nominato Priore a vita della cappella, il quale realizzò a proprie spese il sacello destinato a custodire le reliquie della Santa patrona dei Cavalieri della Nazione Italiana.

Originariamente costituita da un piccolo vano a pianta quadrangolare coperto da una volta costolonata, tra il 1607 e il 1627 la chiesa venne interamente ricostruita su disegno del Cavalier fra’ Fulvio Tassoni, architetto militare che aveva lavorato per il re di Polonia, Sigismondo III Vasa. La primitiva cappellina divenne il vano presbiteriale della nuova costruzione, ampliata mediante l’inserimento di una grande navata ottagonale. L’edificio corrisponde sostanzialmente all’attuale struttura con otto imponenti semipilastri sui quali si impostano gli arconi a tutto sesto che scandiscono le pareti interne: su quattro di essi si aprono le grandi finestre termali che danno luce al vano centrale. Al di sopra si erge la grande cupola suddivisa in otto spicchi da evidenti nervature; le singole vele, sulle quali originariamente si aprivano delle finestre, convergono poi in una lanterna dalla forma allungata. Anche il coro venne modificato per integrare le forme architettoniche cinquecentesche ai nuovi volumi barocchi; a questa fase risale  la realizzazione della piccola cupola sopra l’altare. Nel 1626 venne aperto l’ingresso sul lato che fronteggia la chiesa della Vittoria, con un portale rialzato su gradoni, fiancheggiato da colonne e coronato da stemmi; pochi mesi dopo il primitivo varco d’accesso, che dava adito alla chiesa da Strada Mercanti, venne tamponato come ancora ben visibile nella tessitura muraria dell’esterno.

Intorno alla fine degli anni Cinquanta del Seicento la chiesa di Santa Caterina subì una serie di interventi di manutenzione che prevedevano principalmente la decorazione delle superfici murarie interne. Sono gli anni in cui sull’isola giunge il pittore calabrese Mattia Preti (1613-1699), protagonista della realizzazione dell’intero progetto decorativo della Co-Cattedrale di San Giovanni Battista. Fin dal 1659 l’artista, nominato Cavaliere di Grazia dell’Ordine Gerosolimitano, venne incaricato di sovrintendere ai lavori – che prevedevano di ridipingere il “Cappellone” e la “Cappella piccola” della chiesa – eseguiti dal pittore Leonardo Romei su precise disposizioni del Cavaliere calabrese. Sono dunque risalenti a questi anni le decorazioni a monocromo che ornano, con effetti trompe-l’œil, gli otto spicchi della grande cupola con le Storie di santa Caterina d’Alessandria. Anche la piccola cupola del presbiterio venne decorata, in questo caso direttamente da Mattia Preti il quale vi raffigurò la Gloria Dio Padre tra Angeli; il medesimo soggetto appare dipinto al centro della volta nella Cattedrale di San Giovanni, quasi Preti avesse voluto omaggiare i Cavalieri italiani replicando nella Cappella privata della loro residenza il riquadro più significativo dell’intero ciclo giovannita.

Tuttavia il capolavoro di Mattia Preti nella chiesa resta la grande pala d’altare con la maestosa scena del Martirio di Santa Caterina, realizzata nel 1659 a Napoli e donata ai Cavalieri della Lingua d’Italia quale magnifica prova della sua arte. La tela rappresenta per Malta uno dei primi esempi del talento del Cavaliere calabrese che introdusse sull’isola l’enfasi retorica e l’esuberanza teatrale del linguaggio barocco.

Uscito quasi  indenne dal terribile terremoto che devastò l’isola all’inizio del 1693, l’edificio venne rinnovato al principio del XVIII secolo con l’intervento dell’architetto Romano Carapecchia (1666-1738). Alla facciata, modulata da specchiature rettangolari, venne addossato un imponente pronao, ingentilito da elementi ornamentali scolpiti: ghirlande e festoni, oltre alla corona con le foglie di palma simbolo del martirio della santa di Alessandria.